2026 Hoàng Long. Quy trình các bước thực hiện để chuyển gen sắn thành công

2026  Hoàng Long. Quy trình các bước thực hiện để chuyển gen sắn thành công

Thực hiện chuyển gen thành công trên cây sắn (Manihot esculenta), phương pháp tối ưu và phổ biến nhất hiện nay là thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Cây sắn tương đối khó thao tác, nên quá trình này đòi hỏi sự chính xác cao để tránh việc tế bào chết hoại hoặc tạo ra các cây "trốn chọn lọc" (escapes).

Quy trình chuyển gen sắn qua Agrobacterium

Bước 1: Chuẩn bị mẫu cấy (Explant Preparation)

• Chọn mô đích: Các mô đích tốt nhất để chuyển gen sắn là huyền phù phôi xốp (FES), tử diệp của phôi soma (kích thước ) hoặc phôi soma đang nảy mầm (GSE - cắt thành các mảnh 25–50 ).
• Tạo vết thương: Để vi khuẩn dễ xâm nhập, sử dụng kim vô trùng (ví dụ kim BD1M dài 38mm) châm nhẹ tạo các vết thương nhỏ trên mô phôi soma nảy mầm hoặc lá đỉnh.

Bước 2: Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium

• Nuôi cấy vi khuẩn: Sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mang vector nhị phân (như pHMG, pKYLX hoặc pBI121) chứa gen quan tâm và gen kháng chọn lọc (như kháng hygromycin, paromomycin hoặc chọn lọc bằng mannose).
• Thu sinh khối: Vi khuẩn được nuôi lỏng qua đêm, sau đó ly tâm và hòa huyền phù lại trong môi trường lỏng MS (pH 5.3 - 5.5) có bổ sung acetosyringone, hoặc 1% glucose và 1% galactose. Mật độ quang học () cần được điều chỉnh về mức 0.5 - 1.0 trước khi lây nhiễm.

Bước 3: Lây nhiễm và Đồng nuôi cấy (Inoculation & Co-cultivation)

• Lây nhiễm: Ngâm mẫu cấy vào huyền phù vi khuẩn Agrobacterium trong khoảng 45 phút, lắc nhẹ ở tốc độ 80 rpm.
• Đồng nuôi cấy: Hút bỏ dịch vi khuẩn, thấm khô mẫu cấy bằng giấy lọc vô trùng và chuyển lên môi trường rắn có bổ sung acetosyringone. Ủ mẫu cấy trong bóng tối ở nhiệt độ (thường là ) trong 2 đến 3 ngày.

Bước 4: Rửa vi khuẩn và Chọn lọc (Washing & Selection)

• Rửa vi khuẩn: Rửa sạch mẫu cấy bằng nước vô trùng, sau đó rửa 2-3 lần bằng môi trường MS lỏng chứa kháng sinh carbenicillin (hoặc cefotaxime) để tiêu diệt triệt để vi khuẩn. (Lưu ý: Có thể lấy một vài mẫu để nhuộm thử GUS trong 3-6 giờ ở , nếu xuất hiện kết tủa xanh đậm chứng tỏ T-DNA đã chuyển thành công).
• Chọn lọc: Chuyển mẫu cấy lên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh đặc hiệu (ví dụ hygromycin hoặc paromomycin) và carbenicillin để kìm hãm tế bào không mang gen và diệt vi khuẩn còn sót lại.

Bước 5: Tái sinh phôi và Phát triển chồi (Regeneration)

• Các mô sống sót qua chọn lọc trong 4-6 tuần sẽ tiếp tục phát triển. Đối với huyền phù phôi xốp hoặc phôi nảy mầm, chuyển sang môi trường trưởng thành phôi (RM1 hoặc MSN) có chứa kháng sinh chọn lọc.
• Đối với mô tử diệp, cắt các mầm chồi đang nhú chuyển sang môi trường kéo dài chồi (CEM), rồi sau đó chuyển chồi đã dài (khoảng 1-2 cm) sang môi trường sinh trưởng (CBM hoặc 4E).

Bước 6: Thử nghiệm ra rễ và Thích nghi nhà màng (Rooting & Acclimatization)

• Thử nghiệm ra rễ: Để loại bỏ hoàn toàn các cây "trốn chọn lọc" (escapes), cắt các chồi non cấy vào môi trường ra rễ (như 17N hoặc CBM) có bổ sung kháng sinh (ví dụ hygromycin). Chỉ cây chuyển gen thực sự mới ra rễ bình thường. Trích xuất DNA lá để xác nhận PCR.
• Đưa ra nhà màng: Rửa sạch thạch, trồng cây vào chậu chứa hỗn hợp đất và vermiculite (tỷ lệ 3:1). Trùm kín cây bằng túi nilon trong suốt để giữ độ ẩm cao trong 2-4 tuần đầu ở điều kiện ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ , sau đó mở dần để cây thích nghi.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Zhang, P. & Puonti-Kaerlas, J. (2004). "Regeneration of Transgenic Cassava From Transformed Embryogenic Tissues". Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols (L. Peña, ed.), Humana Press, pp. 165-176. (Tài liệu này hướng dẫn rất chi tiết quy trình sử dụng huyền phù phôi xốp (FES) và tử diệp của phôi soma để chuyển gen thông qua Agrobacterium).
2. Msikita, W., Ihemere, U., Siritunga, D., & Sayre, R. T. (2006). "Cassava (Manihot esculenta Crantz)". Methods in Molecular Biology, vol. 344: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 2 (Kan Wang, ed.), Humana Press, pp. 13-24. (Tài liệu này tập trung vào quy trình chuẩn cho hệ thống sử dụng phôi soma nảy mầm (GSE) cũng như chồi nách, lá đỉnh và các đánh giá về chất chọn lọc như paromomycin)