2026 Hoàng Long. Quy trình các bước thực hiện để nuôi cây mô sắn thành công

2026 Hoàng Long. Quy trình các bước thực hiện để nuôi cây mô sắn thành công

Để nuôi cấy mô sắn thành công, đặc biệt là trong các nghiên cứu cải tiến giống và chuyển gen, hệ thống tạo phôi soma (somatic embryogenesis) và mô sẹo phôi xốp (friable embryogenic callus - FEC) là phương pháp chuẩn xác và hiệu quả nhất. Cây sắn là đối tượng tương đối khó thao tác (recalcitrant), do đó cần tuân thủ nghiêm ngặt quy trình các bước sau đây:

Bước 1: Nuôi cấy tạo phôi soma sơ cấp (Primary Somatic Embryogenesis)

• Mẫu cấy (Explant): Sử dụng chồi ngọn, chồi nách hoặc các thùy lá non (kích thước nhỏ hơn 4 mm) được lấy từ cây in vitro.
• Môi trường: Đặt mẫu cấy lên môi trường MS (Murashige and Skoog) có bổ sung auxin mạnh như 2,4-D (8 mg/L) hoặc picloram (12 mg/L).
• Điều kiện ủ: Nuôi cấy trong bóng tối hoặc dưới ánh sáng rất yếu (khoảng 10-20) ở nhiệt độ 26°C. Sau 14 đến 25 ngày, mẫu cấy sẽ bắt đầu hình thành các cụm mô sẹo phôi đặc (Compact Embryogenic Callus - CEC) hoặc các phôi hình cầu sơ cấp.

Bước 2: Cảm ứng tạo mô sẹo phôi xốp (FEC - Friable Embryogenic Callus)

• Nuôi cấy: Chọn lọc các cụm mô sinh phôi chất lượng cao (CEC) và chuyển sang môi trường rắn GD (Gresshoff and Doy) có chứa 10-12 mg/L picloram.
• Chọn lọc liên tục: Cấy truyền định kỳ 3-4 tuần một lần. Trong quá trình này, các em phải dùng kính hiển vi soi nổi để loại bỏ phần mô sẹo không sinh phôi và chỉ giữ lại cấu trúc FEC tinh sạch (có màu vàng nhạt, cực kỳ xốp, chứa các cụm tế bào chất đặc).

Bước 3: Nuôi cấy tế bào huyền phù (Suspension Cultures - Tùy chọn để nhân nhanh)

• Chuyển khoảng 100-500 mg FEC tinh sạch vào bình tam giác chứa môi trường lỏng SH (Schenk and Hildebrandt) bổ sung 10-12 mg/L picloram.
• Đặt trên máy lắc với tốc độ 108-120 vòng/phút dưới ánh sáng liên tục và phải thay môi trường lỏng thường xuyên (2 lần/tuần hoặc mỗi 3 ngày) để duy trì sức sống của tế bào.

Bước 4: Phát triển phôi và tái sinh chồi (Regeneration) Quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ FEC trải qua các giai đoạn thay đổi hormone:

• Tạo phôi hình thủy lôi (Torpedo stage): Chuyển FEC sang môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA trong 4-6 tuần.
• Trưởng thành phôi (Maturation): Tách các phôi hình thủy lôi chuyển sang môi trường MS bổ sung 0.1 mg/L BAP. Sau 2-6 tuần, phôi sẽ phát triển rõ trụ dưới lá mầm và có lá mầm xanh (cotyledonary stage).
• Kéo chồi (Shoot development): Chuyển các phôi trưởng thành sang môi trường MS có 0.4 - 1 mg/L BAP. Từ 4-8 tuần, phôi sẽ đâm chồi.

Bước 5: Ra rễ và thích nghi nhà màng (Acclimatization)

• Cắt các chồi non chuyển sang môi trường MS cơ bản (có thể giảm nồng độ khoáng xuống 1/3) bổ sung 1 mg/L NAA (hoặc không cần hormone) để kích thích ra rễ.
• Khi cây con đạt 2-4 cm, rửa sạch agar khỏi rễ, đem trồng vào chậu chứa hỗn hợp đất và cát sạch (tỷ lệ 1:3). Che phủ nilon trong 1 tuần đầu để duy trì độ ẩm cao, sau đó mở dần để cây thích nghi với điều kiện nhà màng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Zhang, P., & Puonti-Kaerlas, J. (2004). Regeneration of Transgenic Cassava From Transformed Embryogenic Tissues. (Tài liệu này cung cấp công thức môi trường, cách chọn mẫu cấy, quy trình tạo FEC, cũng như các bước nuôi cấy huyền phù tế bào và tái sinh chồi).
2. Raemakers, K., Pereira, I., Koehorst van Putten, H., & Visser, R. (2005). Indirect Somatic Embryogenesis in Cassava for Genetic Modification Purposes. (Tài liệu này trình bày chi tiết quá trình tạo phôi sinh dưỡng gián tiếp, từ lúc xử lý lá sắn trên môi trường GD và chuyển đổi hormone tuần tự để tái sinh thành cây con hoàn chỉnh).